Experimento con láser de estado sólido-ultravioleta profundo de 222 nm 3
5.2.4 Salida del láser pulsado ultravioleta-de profundidad de 222 nm
Figura 5.16 Variación de la potencia promedio y el ancho de pulso del láser pulsado de 457 nm con potencia de bomba inyectada a una frecuencia de repetición de 15 kHz
El eje izquierdo representa la potencia promedio del láser de 457 nm en mW (200-700), el eje derecho representa el ancho del pulso en ns (40-120) y el eje horizontal representa la potencia de la bomba inyectada en W (30-42).
Una curva corresponde a la potencia promedio a f=15kHz, que disminuye de aproximadamente 650 mW a aproximadamente 350 mW. La otra curva corresponde al ancho del pulso, aumentando desde aproximadamente 50 ns hasta aproximadamente 110 ns.
Figura 5.17 Calidad del haz y del punto del láser pulsado de 457 nm a una potencia promedio máxima de 600 mW con una frecuencia de repetición de 10 kHz (consulte el diagrama de colores)
La parte izquierda es un diagrama de puntos y la parte derecha es un diagrama de calidad del haz.
En el diagrama de calidad del haz, el eje horizontal es la posición a lo largo del eje de propagación en mm (0-200) y el eje vertical es el diámetro del punto en mm (0-4). Hay dos curvas denominadas "x horizontal" e "y vertical", con My²=1.32 y Mx²=1.15.. Las curvas primero disminuyen y luego aumentan, con el valor mínimo alrededor de 100 mm y un diámetro de punto de aproximadamente 0,5 mm.
Del experimento de láser pulsado de 457 nm mencionado anteriormente, la salida del láser pulsado de 457 nm con la potencia máxima más alta se obtiene cuando el radio del punto de bombeo es de aproximadamente 200 μm, L1 y L2 son de aproximadamente 83 mm y 31 mm, y la frecuencia de repetición es de 10 kHz. Este láser pulsado de 457 nm se utiliza como fuente de luz para generar un láser pulsado de 222 nm mediante la duplicación de frecuencia con un cristal BBO. Para que las posiciones de colocación del espejo de enfoque M3 y el cristal BBO logren una salida continua de 222 nm, dado que la calidad del haz de la salida del láser pulsado de 457 nm difiere de la de 457 nm, es necesario ajustar adecuadamente las posiciones de colocación del espejo de enfoque M3 y el cristal BBO. Esto garantiza que después de que el láser pulsado de 457 nm pase a través del espejo de enfoque M3, su longitud Rayleigh coincida con la longitud del cristal BBO para mejorar la eficiencia de duplicación de frecuencia. Finalmente se consigue una salida de láser pulsado de 222 nm con una potencia media máxima de 35 mW y un ancho de pulso de 36 ns (medido por la incidencia directa del láser sobre el detector). Si bien hay opciones comerciales como LED UVC de 222 nm o lámpara UVC de 222 nm para aplicaciones más amplias, este sistema de estado sólido-proporciona una salida pulsada precisa. La figura 5.18 muestra el espectro del láser ultravioleta. La potencia de salida promedio del láser pulsado de 222 nm aumenta con el aumento de la potencia inyectada del láser pulsado de 457 nm, y la relación de variación se muestra en la Figura 5.19. La Figura 5.20 es el diagrama del punto láser del láser pulsado de 222 nm con la potencia de salida promedio más alta.
Figura 5.18 Espectro del láser ultravioleta
El eje horizontal es la longitud de onda en nm (200-260) y el eje vertical es la intensidad (0-15000). El pico ronda los 222 nm.
Figura 5.19 Variación de la potencia de salida promedio del láser pulsado de 222 nm con la potencia inyectada del láser pulsado de 457 nm a una frecuencia de repetición de 10 kHz
El eje horizontal es la potencia inyectada del láser de 457 nm en mW (200-600) y el eje vertical es la potencia promedio del láser de 222 nm en mW (0-40). La curva aumenta linealmente, desde aproximadamente 5 mW hasta alrededor de 35 mW.
Figura 5.20 Punto láser de láser pulsado de 222 nm con la potencia de salida promedio más alta (consulte el diagrama de colores)
La mancha tiene forma de anillo con un contorno cuadrado.
Figura 5.21 Estabilidad de la potencia de salida del láser pulsado de 222 nm
Cuando la potencia de salida promedio máxima del láser pulsado de 222 nm es de 35 mW, se mide la estabilidad de la potencia de salida del láser. Como se muestra en la Figura 5.21, la estabilidad de la salida del láser en 2 horas está dentro del 2%.
El eje horizontal es el tiempo en minutos (0-120) y el eje vertical es la potencia promedio del láser de 222 nm en mW (0-50). La curva es básicamente estable y fluctúa alrededor de 35 mW.
5.3 Experimento de inactivación bacteriana mediante láser pulsado de 222 nm
5.3.1 Principio y ventajas de la aplicación de la luz ultravioleta-lejana para la inactivación bacteriana
En 1903, Niels Finsen recibió el Premio Nobel por descubrir que la luz ultravioleta puede matar bacterias. Durante el siglo siguiente, la luz ultravioleta se utilizó ampliamente como método de desinfección para desinfectar artículos, salas y otros lugares públicos. Durante la actual pandemia de COVID-19, los países de todo el mundo necesitan urgentemente nuevos métodos para inactivar los virus en el aire. Existen dos métodos principales de esterilización y desinfección fotodinámica: acción fotoquímica y acción fototérmica.
(1) Acción fotoquímica Los ácidos nucleicos de información genética (ADN/ARN) de las bacterias absorben una gran cantidad de luz ultravioleta cuando se irradian. Esto conduce a la formación de isómeros de diazabencenos y diazabencenos en el cuerpo, como se muestra en la Figura 5.22. Esta sustancia altera las funciones metabólicas de las bacterias, impidiéndoles reproducirse hasta morir. Esta acción fotoquímica es el principal mecanismo de desinfección de la luz ultravioleta tradicional. Sin embargo, para los microorganismos de moho y esporas, la luz ultravioleta tiene dificultades para penetrar sus densas estructuras de pared celular, por lo que el ADN no puede absorber la luz ultravioleta, lo que resulta en una eficiencia de desinfección relativamente baja para estos microorganismos.
Figura 5.22 Diagrama esquemático de la dimerización con timina de ADN bicatenario -bajo irradiación con luz ultravioleta (consulte el diagrama de colores)
Muestra el proceso por el que el ADN bicatenario-forma dímeros de timina bajo radiación ultravioleta.
(2) Acción fototérmica La irradiación de luz pulsada puede aumentar rápidamente la temperatura de la superficie de las células, destruyendo las paredes celulares de las bacterias, evaporando el líquido celular y dañando completamente las estructuras celulares, provocando la muerte. La acción fototérmica es el aumento de temperatura provocado por la absorción de energía luminosa por parte de sustancias. Cuando los microorganismos son irradiados por luz pulsada intensa a corta distancia, absorben una gran cantidad de energía luminosa en poco tiempo, lo que hace que la temperatura de su superficie aumente bruscamente y sus estructuras superficiales queden completamente destruidas, provocando la muerte. Dado que todo el proceso de acción fototérmica es muy corto, no hay aumento de temperatura dentro del objeto irradiado, por lo que básicamente no afecta a los nutrientes. Según el mecanismo de desinfección fototérmica, la luz pulsada intensa puede matar eficazmente todos los microorganismos. La luz ultravioleta pulsada combina acciones fotoquímicas y fototérmicas para la esterilización y desinfección, por lo que su eficiencia teórica de desinfección es mayor que la de un solo método. La fuente de luz ultravioleta tradicional para la esterilización es una lámpara de vapor de mercurio. Sin embargo, la longitud de onda máxima de la luz ultravioleta emitida por las lámparas de vapor de mercurio es de 254 nm, lo que es perjudicial para las células y tejidos humanos y puede provocar cáncer de piel [4] y cataratas en casos graves. Las investigaciones de la última década han demostrado que la luz ultravioleta en la banda de 200-230 nm puede inactivar bacterias, virus de la influenza en el aire y patógenos como el SARS-CoV-2 sin dañar las células humanas. Internacionalmente, la luz ultravioleta-profunda en la banda de 200-230 nm se denomina "luz ultravioleta-lejana", y a menudo se implementa mediante sistemas de luz ultravioleta lejana de 222 nm. En 2022, los Juegos Olímpicos de Invierno de Beijing utilizaron ampliamente la luz ultravioleta -lejana para la esterilización y desinfección, refiriéndose a ella como una "vacuna ligera". Para aquellos que buscan luz ultravioleta de 222 nm a la venta, las opciones incluyen módulos LED de 222 nm uvc o lámparas uvc de 222 nm, que ofrecen beneficios similares de luz ultravioleta lejana de 222 nm en formas compactas. En comparación con la típica luz ultravioleta de 254 nm para esterilización, el principio biofísico de que la luz ultravioleta lejana es inofensiva para las células humanas es que las proteínas tienen un pico de absorción en esta banda. En este experimento, se utiliza un espectrofotómetro para medir el espectro de absorción de proteínas, como se muestra en la Figura 5.23. En la Figura 5.23 se puede ver que las proteínas tienen una absorción de luz muy baja en la banda típica de 254 nm, pero una absorción relativamente alta en la banda de 200-230 nm. La luz ultravioleta lejana puede atravesar microorganismos mucho más pequeños que las células humanas (los diámetros típicos de las bacterias y los virus son 1 μm y 0,1 μm) [11], mientras que el diámetro de las células humanas típicas oscila entre 10 y 25 μm. La luz ultravioleta lejana es fuertemente absorbida por las proteínas del citoplasma humano y atenuada bruscamente antes de llegar al núcleo de la célula humana [6]. Por ejemplo, la capa más externa de la piel humana es el estrato córneo, compuesto por queratinocitos anucleados muertos. La función principal del estrato córneo es proteger el tejido subcutáneo subyacente. La mayor parte de la luz ultravioleta lejana irradiada es absorbida por proteínas en el citoplasma del estrato córneo de la piel y no puede penetrar el estrato córneo de la piel para alcanzar las células basales clave o los melanocitos que se encuentran debajo, como se muestra en la Figura 5.24. Para los ojos humanos, el tejido sensible a la luz ultravioleta es el cristalino. Sin embargo, la lente está ubicada en la parte posterior de la córnea y la córnea tiene aproximadamente 500 μm de espesor. Por lo tanto, la transmitancia de la luz ultravioleta lejana a través de la córnea hasta el cristalino es básicamente cero.
Figura 5.23 Espectro de absorción de proteínas
El eje horizontal es la longitud de onda en nm (200-300) y el eje vertical es el valor de absorción (0-3,0). Hay tres puntos en la curva: (222, 1,41), (230, 1,25) y (254, 0,168). El valor de absorción disminuye a medida que aumenta la longitud de onda.
Figura 5.24 Diagrama esquemático de la propagación de la luz ultravioleta-lejana en la piel y los patógenos
El lado izquierdo muestra la estructura de la piel, donde el estrato córneo absorbe la luz ultravioleta-lejana. El lado derecho muestra el patógeno ampliado, donde la luz ultravioleta-lejana penetra y actúa sobre bacterias y virus.
5.3.2 Experimento de inactivación bacteriana mediante láser pulsado de 222 nm
Preparación bacteriana Escherichia coli está ampliamente presente en la naturaleza y es un patógeno clave en la salud pública humana, una de las especies de enterobacterias más-resistentes a los medicamentos y se utiliza a menudo en investigaciones sobre desinfección ultravioleta e higiene ambiental. Bacillus está estrechamente relacionado con los humanos en la causa de intoxicación alimentaria y, debido a la resistencia al calor y a los ácidos de sus esporas, no puede eliminarse mediante pasteurización ni procedimientos de higiene normales. Por tanto, las cepas bacterianas utilizadas en este experimento son Escherichia Coli y Bacillus Cereus. Escherichia coli y Bacillus son Escherichia coli [Escherichia coli CMCC (B) 44102] proporcionados por el Laboratorio Clave de Ecología de Islas Tropicales del Ministerio de Educación, Universidad Normal de Hainan, y Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki HD-1 del Laboratorio de Investigación de Ecología de Microbiología Ambiental de la Universidad Normal de Hainan, respectivamente. Escherichia coli y Bacillus se cultivan en medio agar nutritivo, se colocan en una incubadora a 35 grados y 5% de CO₂, con un período de cultivo de 24 h. El medio de agar nutritivo lo proporciona Guangdong Huankai Microbial Technology Co., Ltd. y sus componentes incluyen peptona, extracto de carne en polvo, cloruro de sodio y agar, con un pH final ≈ 7,3. Las bacterias cultivadas se observan mediante la preparación de portaobjetos. Tomando Escherichia coli como ejemplo, sus pasos de preparación de portaobjetos se muestran en la Figura 5.25 y los resultados de la observación se muestran en la Figura 5.26.
Toma de portaobjetos: Los portaobjetos se almacenan en una solución de alcohol, se sacan y se secan con un soplador de aire caliente.
Gota de agua esterilizada: debajo de una mesa de trabajo súper-limpia, deja caer una gota de agua esterilizada en el portaobjetos (no demasiado grande) para diluir las bacterias.
Muestreo: Utilice el extremo plano de un palillo esterilizado para sumergir suavemente las bacterias de la colonia; el palillo no se puede reutilizar.
Agitación: Revuelva las bacterias en el sentido de las agujas del reloj para que se distribuyan completa y uniformemente en la gota de agua.
Hornear: Seque el portaobjetos tratado para fijar las bacterias en el portaobjetos.
Tinción: Deje caer el reactivo Azul Brillante de Coomassie (tóxico, opere con guantes) sobre el portaobjetos, haciendo que la gota cubra apenas la placa bacteriana, y déjelo reposar por más de 15 segundos.
Enjuague: Enjuague el exceso de reactivo Coomassie Brilliant Blue con un flujo lento de agua, teniendo cuidado de no enjuagar la placa bacteriana directamente para evitar lavarla.
Observación: Coloque el portaobjetos en la platina del microscopio, deje caer una gota de aceite sobre la placa bacteriana y luego observe con una lente de inmersión en aceite.
Figura 5.25 Pasos de preparación del portaobjetos bacteriano
Incluye un proceso pictórico de ocho pasos: "tomar y secar portaobjetos", "gota de agua esterilizada", "muestrear", "revolver", "hornear", "teñir", "enjuagar" y "observación".
Figura 5.26 Imagen del bacilo observado al microscopio
Muestra una gran cantidad de bacilos-en forma de bastón.
Efecto de la inactivación bacteriana La fuente de irradiación es un láser ultravioleta lejano- pulsado en estado totalmente{1}}sólido-de 222 nm desarrollado en este trabajo, con un ancho de línea espectral inferior a 0,1 nm. Toda la operación experimental se lleva a cabo en una sala limpia. Las herramientas experimentales se esterilizan utilizando un esterilizador de alta -presión y la mesa de trabajo se irradia con luz ultravioleta durante 1 hora antes del experimento para evitar la contaminación bacteriana del medio ambiente. La cubeta se sella después de colocar la suspensión bacteriana para evitar el contacto directo de la suspensión con el aire exterior. Durante todo el experimento, las bacterias se encuentran en líquido nutritivo para evitar errores experimentales causados por la muerte natural. Tomar muestras de 1ml de suspensiones de Escherichia coli y Bacillus con una determinada concentración y colocarlas en una cubeta con alta transmisión en la banda ultravioleta de onda corta-. Encienda el láser y, al ajustar la potencia de salida del láser y la posición de colocación de la cubeta, la irradiancia del láser de 222 nm en la cubeta es de 0,1 mW/cm². Utilice un láser de 0,1 mW/cm² de 222 nm para irradiar muestras de suspensión de Escherichia coli y Bacillus para diferentes tiempos de irradiación. La Figura 5.27 (a) muestra un láser de 222 nm pasando verticalmente a través de la suspensión de Escherichia coli. Las muestras de control y las muestras irradiadas se cultivan durante otras 24 h, y la distribución de las bacterias irradiadas y no irradiadas se muestra en las Figuras 5.27 (b) y (c). El método de recuento en placa de agar nutritivo se utiliza para determinar el recuento bacteriano de Escherichia coli en el grupo de control y después de la irradiación. Para mejorar la precisión de los datos experimentales, cada muestra se repite 3 veces bajo la misma dosis de irradiación y se toma el valor promedio.
Experimento de esterilización por láser pulsado de figura 5.27 222nm
(a) Suspensión de Escherichia coli bajo irradiación;
(b) Distribución de Escherichia coli después de 0, 10 y 20 segundos de irradiación, con el número de colonias en la placa disminuyendo al aumentar el tiempo de irradiación;
(c) Distribución de Bacillus después de 0, 30 y 60 segundos de irradiación, con el número de colonias en la placa disminuyendo al aumentar el tiempo de irradiación.
Los resultados de la prueba se enumeran en la Tabla 5.1. Cuando el láser de 222 nm irradia la suspensión de Escherichia coli durante 10 s (1 mJ/cm²), la tasa de inactivación es del 90,7 %; durante 15 s (1,5 mJ/cm²), la tasa de inactivación es del 96,9 %; y durante 20 segundos (2 mJ/cm²), la tasa de inactivación llega al 100 %. Cuando el láser de 222 nm irradia la suspensión de Bacillus durante 30 s (3 mJ/cm²), la tasa de inactivación es del 88,4 %; durante 45 segundos (4,5 mJ/cm²), la tasa de inactivación llega al 98,6 %; y durante 60 segundos (6 mJ/cm²), la tasa de inactivación llega al 100 %. Este estudio experimental muestra que la irradiación con láser pulsado ultravioleta lejano de 222 nm en dosis de 2 mJ/cm² y 6 mJ/cm² puede inactivar eficazmente Escherichia coli y Bacillus, respectivamente. Se puede ver en este experimento y en otros informes bibliográficos que la dosis de irradiación necesaria para inactivar Bacillus mediante luz ultravioleta es mayor que la de Escherichia coli. La razón es que la dosis de irradiación necesaria para inactivar bacterias y virus mediante luz ultravioleta está relacionada principalmente con factores como el tamaño de los microorganismos, el grosor de las membranas celulares (paredes) y la estructura de los ácidos nucleicos (monocatenarios o bicatenarios-). Generalmente, cuanto mayor es el tamaño del microorganismo y más gruesa es la membrana celular, mayor dosis de irradiación se requiere; Los microorganismos con estructuras bicatenarias-tienen mayores capacidades de reparación que aquellos con estructuras monocatenarias,-por lo que también se requiere una mayor dosis de irradiación. Tanto Bacillus como Escherichia coli tienen estructuras bicatenarias, pero el tamaño y el grosor de la pared celular de Bacillus son (1,0~1,2) nm × (3,0~5,0) nm y 20~80 nm, respectivamente, mientras que los de Escherichia coli son solo (0,5~0,8) nm × (1,0~3,0) nm y 11 nm. Por lo tanto, la dosis de irradiación ultravioleta necesaria para inactivar Bacillus es mayor que la de Escherichia coli.
